三维荧光也就是激发‑发射矩阵扫描，属于荧光光谱仪高级扫描模式，下面为通用操作流程，不同品牌软件菜单名称略有区别。
一、前期准备与样品处理
1. 样品预处理。浑浊样品需要离心或者0.22μm滤膜过滤，悬浮颗粒会带来严重散射干扰；浓度偏高样品提前稀释，避免内滤效应造成荧光峰失真。
2. 准备空白溶剂，与样品所用溶剂完全一致（超纯水、色谱纯溶剂）。
3. 选用四面透光石英荧光比色皿，拿取只捏两侧磨砂面，不要触碰透光面；装入溶液至容器2/3位置，擦镜纸擦干外壁水渍指纹。
二、三维荧光光谱仪开机与仪器预热
1. 依次打开荧光分光光度计主机、氙灯电源，开启电脑，启动配套控制软件，仪器自动通讯初始化。
2. 光源预热30 min以上，氙灯光源、光电倍增管信号达到稳定，才可开展三维扫描；尽量不要短时间反复开关氙灯，延长光源寿命。
三、参数设置（进入3D‑Scan三维扫描模式）
在软件中选择三维扫描 /EEM扫描模式，依次配置下面参数：
1. 激发波长Ex范围：例如 200‑500 nm；
2. 发射波长Em范围：例如 250‑600 nm；
> 重要：发射起始波长建议比当前激发波长大10 nm以上，避开一级瑞利散射区域。
3. 波长步长（采样间隔）：常规检测5 nm；精细图谱可用2‑3 nm；步长越小扫描耗时越长。
4. 狭缝带宽：激发狭缝、发射狭缝分别设置，常规5‑10 nm。狭缝大，信号强，分辨率下降。
5. 扫描速度、积分时间：常规选中速；弱荧光样品适当加长积分时间，提升信噪比。
6. PMT检测器增益电压：根据样品荧光强弱调整，不要设置过高导致信号饱和。
7. 开启自动截止滤光片（如仪器自带），降低散射干扰。
四、空白基线扫描（必不可少）
1. 将装好空白溶剂的比色皿放入样品仓，透光面对准光路，关闭仓盖。
2. 执行空白三维扫描。保存空白图谱，后续用于软件扣除溶剂背景荧光。
五、待测样品扫描
1. 取出空白比色皿，放入待测样品。
2. 关闭样品室，点击开始扫描。扫描过程仪器将逐次改变激发波长，每一个激发波长下完成一条发射光谱扫描，最终生成整套EEM矩阵数据。
>扫描期间禁止打开样品仓盖子，避免强光直射光电倍增管造成损伤。
3. 扫描完成后，保存原始三维数据文件与等高线图谱。
多个样品连续测试，建议每隔5‑8个样品复测一次空白，监控基线漂移。
六、扫描后数据预处理（实验室常规流程）
导出原始数据后，一般还需要后期处理：
1. 扣除空白溶剂荧光；
2. 去除瑞利散射、拉曼散射；
3. 高浓度样品校正内滤效应；
4. 需要多样品对比时，做纯水拉曼峰归一化处理；
5. 绘制三维等高线图、曲面图，读取荧光特征峰位置；如需深度分析可做PARAFAC平行因子解析。
七、关机流程
1. 先关闭氙灯光源；
2. 等待光源散热几分钟，退出测量软件；
3. 关闭主机电源、电脑；
4. 取出比色皿，立刻清洗干净晾干；清理样品仓洒落液体，盖上仪器防尘罩。
三维荧光光谱仪关键注意事项
1. 光敏感样品，三维扫描耗时较长，容易发生光降解，可适当降低PMT电压、加快扫描速度；
2. 不要在扫描中途强行终止测试，容易造成数据残缺；
3. 定期使用硫酸奎宁标准溶液校验仪器波长、灵敏度。